Covid-19 ve Gümüş Suyu
Covid-19 ve gümüş suyu – Gümüş nanopartiküllerin SARS-CoV-2 üzerindeki güçlü antiviral etkisi
Özet
COVID-19 salgını, etkili antiviral önlemlerin bulunmaması nedeniyle kontrolsüz bir şekilde yayılıyor. Gümüş nanopartiküller (AgNP), antiviral özelliklere sahip olduğu için incelenmiştir ve SARS-CoV-2’yi inhibe ettiği varsayılmaktadır. SARS-CoV-2’ye karşı etkili bir ajan ihtiyacından dolayı, AgNP’lerin antiviral etkisini değerlendirdik. Farklı boyutlarda ve konsantrasyonlarda bol miktarda AgNP’yi değerlendirdik ve 10 nm çapındaki partiküllerin, 1 ile 10 ppm arasındaki konsantrasyonlarda hücre dışı SARS-CoV-2’yi inhibe etmede etkili olduğunu, sitotoksik etki ise 20 ppm ve üzerindeki konsantrasyonlarda gözlendi. . Lusiferaz bazlı psödovirüs giriş analizi, AgNP’lerin viral bütünlüğü bozarak viral giriş aşamasını potansiyel olarak inhibe ettiğini ortaya koydu. Bu sonuçlar, AgNP’lerin SARS-CoV-2’ye karşı oldukça güçlü mikrop öldürücüler olduğunu, ancak sitotoksik etkileri ve uygun şekilde atılmadıklarında çevresel ekosistemleri bozma potansiyelleri nedeniyle dikkatli kullanılmaları gerektiğini göstermektedir.
1. Giriş
Temel metal olan Silver (Ag), çeşitli bakteri, mantar ve virüslere karşı geniş spektrumlu antimikrobiyal etkiye sahiptir. Ag nanopartiküller (AgNP), çok yönlülükleri nedeniyle şu anda biyolojik yüzeyler için yara sargıları, tıbbi cihazlar, deodorant spreyleri ve kumaşlar gibi çeşitli formlarda bir mikrobisid olarak yollarını bulmuşlardır. Çeşitli çalışmalar, Solunum sinsitiyal virüsü (RSV), İnfluenza virüsü, Norovirüs, Hepatit B virüsü (HBV) ve İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) gibi çeşitli insan patojenik virüslere karşı AgNP’lerin güçlü antiviral etkisini göstermiştir. Bu virüslere ek olarak, Ag’nin SARS-CoV’yi öldürdüğü gösterildiğinden, AgNP’lerin SARS-CoV-2’yi inhibe etme olasılığının güçlü olduğunu varsaydık. Bugüne kadar AgNP’lerin SARS-CoV-2 üzerindeki etkisini doğrudan gösteren hiçbir çalışma yoktur. SARS’ı engelleyebilecek en etkili Ag boyutunu ve konsantrasyonunu bulmak için kolloidal gümüş (cAg), farklı çaplarda düz elementel Ag nanopartiküller (AgNPn) ve polivinilpirolidon kaplı 10 nm gümüş nanopartiküller (PVP-AgNP10) ile SARS-CoV-2’ye karşı test ettik -CoV-2. AgNP’lerin, devam eden COVID-19 pandemisini verimli bir şekilde kontrol etmek için cansız ve biyolojik olmayan yüzeylerde kullanılabileceğini ve aynı zamanda kötüye kullanmamaya özen göstereceğini öneriyoruz.
2. Malzemeler ve yöntemler
2.3 Gümüş formülasyonlar
20 ppm stok konsantrasyonunda (Kat No: 795925) ve cAg’de (Kat No: 85131) PVP-AgNP10 Sigma’dan elde edildi. Farklı boyutlarda AgNP’ler; AgNP2 (Kat No: US7150), AgNP15 (Kat No: US7091), AgNP50, AgNP80 ve AgNP100 (US1038W), US Research Nanomaterials, Inc.’den satın alınmıştır. Tüm Silver formülasyonları su içinde dağıtılmıştır ve istenen konsantrasyon seyreltilerek hazırlanmıştır. steril damıtılmış suda.
3. Gümüş ve SARS CoV-2 etkileşim çalışmaları
3.1 Virüs ön tedavi deneyi
% 2 FBS içeren DMEM içinde 0.05 MOI (VeroE6 / TMPRSS2 için) veya 0.5 (Calu-3 için) olan virüs, 37 ° C’de 1 saat boyunca 2 ppm AgNP çözeltisi ile inkübe edildi. Karşılık gelen virüs-AgNP karışımı, 96 oyuklu plakalarda VeroE6 / TMPRSS2 veya Calu-3 hücrelerine ilave edildi ve 37 ° C’de sırasıyla 48 saat veya 96 saat inkübe edildi. Hücre canlılığı, CellTiter-Glo deneyi ile nicelendirildi ve süpernatant içindeki viral kopyalar, RT-qPCR ile ölçüldü.
3.2 Tedavi sonrası hücre analizi
VeroE6 / TMPRSS2 hücreleri SARS-CoV-2 (MOI = 0.05) ile enfekte edildi ve 2 saat 37 ° C’de inkübe edildi. Kuyucuklar hücre dışı virüsleri uzaklaştırmak için PBS ile yıkandı ve 2 ppm PVP-AgNP10 ile% 2 FBS içeren DMEM ile dolduruldu ve 48 saat 37 ° C’de inkübe edildi. Hücre canlılığı, CellTiter-Glo deneyi ile nicelendirildi ve süpernatant içindeki viral kopyalar, RT-qPCR ile ölçüldü.
3.3 Hücre ön işlem deneyi
VeroE6 / TMPRSS2 hücreleri 2 ppm PVP-AgNP10 ile işleme tabi tutuldu ve 3 saat 37 ° C’de inkübe edildi. Çukurlar daha sonra ortamdaki serbest AgNP’leri uzaklaştırmak için PBS ile yıkandı ve SARS-CoV-2 (MOI = 0.05) ile% 2 FBS içeren DMEM ile dolduruldu ve 48 saat boyunca 37 ° C’de inkübe edildi. Hücre canlılığı, CellTiter-Glo deneyi ile nicelendirildi ve süpernatant içindeki viral kopyalar, RT-qPCR ile ölçüldü.
4. Sonuçlar
4.1 Sitotoksisite, etkili doz ve temas süresi
AgNP’ler, reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturarak memeli hücrelerine sitotoksisite gösterir. Ag’nin VeroE6 / TMPRSS2 (insan dışı kaynaklı) ve Calu-3 (insan akciğer epitel hücresi) hücre hatları üzerinde sergilediği konsantrasyona bağlı sitotoksisiteyi değerlendirmek istedik. cAg seri olarak seyreltildi ve hücrelere 96 oyuklu plakalarda ilave edildi ve hücre canlılığı, CellTiter-Glo deneyi kullanılarak 48 saat sonra değerlendirildi. Ag’nin, hem VeroE6 / TMPRSS2 (Şekil 1 A) hem de Calu-3 hücre hatlarında (Şekil 1B) milyonda 20 kısımdan (ppm) itibaren konsantrasyonlarda sitotoksisite sergilediği bulunmuştur.
CAg, 1 ila 1000 nm arasında değişen partikül boyutları içerdiğinden, bunu AgNP’lerin SARS-CoV-2 üzerindeki etkisini belirlemek için bir başlangıç taraması olarak kullandık. SARS-CoV-2 enfeksiyon çokluğu (MOI), bağımsız deneylerle hesaplandı ve VeroE6 / TMPRSS2 ve Calu-3 için sırasıyla 0.05 ve 0.5 olarak bulundu. Sabit bir MOI’deki viral süspansiyon, 1 saat boyunca her seri cAg seyreltmesi ile işleme tabi tutuldu ve daha sonra VeroE6 / TMPRSS2 ve Calu-3 hücrelerine aşılandı. Enfekte VeroE6 / TMPRSS2’nin hücre canlılığı, virüs tarafından öldürülen hücrelerin oranını belirlemek için 48 saat sonra değerlendirildi ve viral yük, 96 saat sonra gerçek zamanlı ters transkriptaz kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) kullanılarak Calu-3 hücrelerinde ölçüldü cAg, 1 ile 10 ppm arasında değişen konsantrasyonlarda enfekte VeroE6 / TMPRSS2 hücrelerinin artan canlılığı ile ifade edilen güçlü antiviral etki gösterdi (Şekil 2 A). Calu-3 hücrelerinde, benzer cAg konsantrasyon aralığında önemli viral yük azalması gözlemlendi (Şekil 2B). Metal iyonları yüksek konsantrasyonlarda PCR’nin bilinen inhibitörleri olsa da, etkili konsantrasyonda (2 ppm) Ag’nin amplifikasyonu inhibe etmediğini ve Ag içeren örneklerde viral RNA’yı analiz etmek için uygun olduğunu doğruladık (Şekil S1) [9]. 2 ppm ayrıca sitotoksik konsantrasyondan 10 kat daha düşük olduğu için, daha ileri testler için istenen konsantrasyon olarak seçildi.
Önceki çalışmalar, viral inaktivasyonda AgNP’lerin boyuta bağlı potensini belgelemiştir ve ≤10 nm partikül boyutunun maksimum antiviral etkiye sahip olduğu bildirilmiştir. CAg, değişen boyutlarda Ag parçacıkları içerdiğinden, cAg’de yaklaşık 10 nm boyutundaki parçacıkların antiviral etki uygulayacağını tahmin ettik. Bunu kanıtlamak için, hücre dışı virüsler üzerinde 2 ila 100 nm arasında değişen farklı boyutlardaki AgNP’lerin antiviral etkisini test etmek için virüs ön muamele tahlilini (VPrA) kullandık. Virüs, 1 saat süreyle farklı boyutlarda 2 ppm AgNP çözeltisi ile muamele edildi ve virüs-AgNP karışımı, VeroE6 / TMPRSS2 ve Calu-3 hücrelerine ilave edildi. Hücre canlılığı, VeroE6 / TMPRSS2’de CellTiter-Glo deneyi ile ölçüldü ve süpernatanttaki viral kopyalar, Calu-3 hücrelerinde RT-qPCR ile ölçüldü. Antiviral etki, 2 ila 15 nm arasında değişen boyuttaki AgNP’ler ile kaydedildi. AgNP2, 2 ppm’de sitotoksisite gösterirken diğer boyutlar göstermedi. Bu nedenle daha ileri testler için PVP-AgNP10’u seçtik. 1. saatte VPrA’da mükemmel antiviral aktivite gözlemlediğimizden, viral inhibisyon için Ag’nin gerektirdiği minimum temas süresini bilmek istedik. PVP-AgNP10 ile VPrA’ya dayalı olarak gerçekleştirilen zaman süreci çalışması, 30 dakikalık temasın ötesinde önemli inhibisyonu ortaya çıkardı.
4.2 Gümüş, viral girişi önleyerek hücre dışı virüsleri inhibe eder
Daha sonra, Ag’nin hücre dışı ve hücre içi virüsler üzerindeki etkisini gözlemlemek için VeroE6 / TMPRSS2’de PVP-AgNP10 kullanarak SARS-CoV-2 üzerinde VPrA, tedavi sonrası hücre analizi (CPoA) ve hücre ön tedavi analizini (CPrA) gerçekleştirdik. VPrA, hem hücre ölümünün azalması hem de viral yükte ihmal edilebilir seviyelere ani bir düşüş ile karakterize edilen hücre dışı serbest viryonların etkili bir şekilde inhibe edildiğini gösterdi. Ayrıca, Ag’nin zaten enfekte olmuş hücrelerdeki virüsü baskılama yeteneğini saptamak için CPoA’yı gerçekleştirdik. Bu deneysel tasarımda, VeroE6 / TMPRSS2 hücrelerinin 2 saat SARS-CoV-2 (MOI 0.05) ile enfekte edilmesine izin verildi, ardından hücre dışı virüsler yıkandı ve ardından enfekte hücreler 2 ppm PVP-AgNP10 ile işleme tabi tutuldu. Enfekte hücrelerin önemli ölçüde korunduğunu ve viral yükün PVP-AgNP10 ile bastırıldığını gözlemledik. Ek olarak, gümüş ile önceden işlenmiş hücrelerin viral enfeksiyona direnme yeteneğini değerlendirmek için CPrA’yı gerçekleştirdik. VeroE6 / TMPRSS2 hücreleri, 3 saat boyunca 2 ppm PVP-AgNP10 ile inkübe edildi, ardından hücreler, bağlanmamış gümüşü çıkarmak için yıkandı, ardından SARS-CoV-2 (MOI 0.05) ile enfeksiyon yapıldı. 48 saatin sonunda virüsün sadece kısmen inhibe edildiği bulundu.
PVP-AgNP10’un boyuta bağlı antiviral etkisini, VPrA deneysel modelinde yürütülen immünofloresan analizini kullanarak doğruladık; SARS-CoV-2 enfeksiyonu, AgNP100 tarafından değil, AgNP10 tarafından etkili bir şekilde önlendi. Plak deneyi, gümüşün, virüs kontrolünden bir log10 kat daha fazla olan 0.05 MOI’lik tam inhibisyona ulaştığını ortaya koydu. 0.5 MOI’den başlayarak daha yüksek viral yüklerle kısmi inhibisyon gözlendi. AgNP’lerin viral girişteki rolünü değerlendirmek için lusiferaz bazlı psödovirüs giriş tahlilini gerçekleştirdik. PVP-AgNP10, kontrol olarak kullanılan nötralize edici antikorunkine benzer lusiferaz aktivitesinin önemli ölçüde azalmasıyla karakterize edilen psödoviral girişi potansiyel olarak inhibe etti.
5. Tartışma
Ag, antimikrobiyal etkisi ile uzun zamandır bilinmektedir ve AgNP’lerin antiviral özelliği, yakın geçmişte yenilenen ilgi ile kapsamlı bir şekilde araştırılmaktadır . AgNP’lerin virüsler üzerinde öldürme etkisini gerçekleştirdiği kesin mekanizma hala belirsizdir. Bununla birlikte, AgNP’lerin, viral bağlanmayı veya girişi önleyerek veya viryonların yapısal bütünlüğünü etkilemek için yüzey proteinlerine zarar vererek erken aşamada enfeksiyonu inhibe etmek için hücre dışı virüslerin yüzeyindeki yapısal proteinlerle etkileşime girdiği sürekli olarak gözlemlenmiştir. Mevcut çalışmada, hedef hücreleri enfeksiyondan korumak için AgNP’lerin hücre dışı SARS-CoV-2’yi etkili bir şekilde inhibe ettiği VPrA’da benzer bulgular elde ettik ve psödovirüs giriş testi, AgNP’lerin viral girişi engellediğini ortaya çıkardı.
AgNP’lerin sülfhidril grupları açısından zengin viral yüzey proteinlerine tercihli olarak bağlandıkları ve proteini destabilize etmek için disülfid bağlarını böldüğü ve böylece viral enfektiviteyi etkilediği gösterilmiştir. HIV üzerine yapılan çalışmalar, AgNP’lerin, gp120 yüzey proteininin CD4 bağlama alanına çok yakın olan disülfid bağlarıyla ilişkili olduğunu göstermiştir. Hati ve Bhattacharyya, SARS-CoV-2 spike proteininin anjiyotensin dönüştürücü enzim-2 (ACE2) reseptörü ile bağlanmasında disülfit bağlarının önemini ve bozulması reseptöre viral bağlanmanın bozulmasına yol açtığını göstermiştir. Diğer yazarlar tarafından gösterilen AgNP’lerin etki mekanizması göz önüne alındığında, AgNP’lerin antiviral etkilerini, sivri protein ve ACE2 reseptörleri üzerindeki disülfid bağlarını bozarak SARS-CoV-2 üzerinde uyguladıkları varsayılabilir. SARS-CoV-2 üzerindeki AgNP’lerin antiviral mekanizmasını bulmak ve daha sonra detaylı olarak aydınlatmak için daha ileri çalışmalar yapılmaktadır.
AgNP’lerin ayrıca viral nükleik asitlerle etkileşime girerek hücre içi antiviral etkiye sahip oldukları iddia edilmiştir . PVP-AgNP10 ile önceden işlemden geçirilmiş hücrelerde viral yükte bir miktar azalma olduğu için CPrA’da kısmi bir antiviral etki gözlemledik. Bu etkinin nedeni şu anda bilinmemekle birlikte, muhtemelen ACE2 reseptörü üzerindeki disülfür köprülerinin tahrip edilmesinden veya gerçek bir hücre içi mekanizmadan kaynaklandığı (burada, enfekte olmuş hücrelerden yeni üretilen virüsün seri viral enfeksiyonunu inhibe ederek) açıklanmaktadır. enfekte olmamış hücrelere). Ayrıca Ag, spesifik olmayan bir şekilde proteinlere bağlandığından, antiviral ajanlar olarak kullanımları da bazı hücresel işlev bozukluklarına neden olabilir. Ag’nin in vivo bütünsel etkisini daha kesin bir şekilde açıklamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Birkaç çalışma, AgNP’lerin boyuta bağlı antiviral etkisinin 10 nm çapa yakın partiküllerle en etkili olduğunu yinelemiştir. Bu, daha büyük partiküller tarafından yetenekli olmayan 10 nm partiküllerle elde edilen viral proteine daha yüksek etkileşim stabilitesi atfedilmiştir. Bununla tutarlı olarak, anti-SARS-CoV-2 aktivitesini sadece 2 ila 15 nm arasında değişen çaplarda AgNP ile gözlemledik. İmmünofloresan çalışmamız, PVP-AgNP10’un SARS-CoV-2’yi tamamen inhibe ettiğini ancak AgNP100’ün bunu yapmadığını gözlemlediğimiz için yukarıdaki fenomeni doğruladı.
AgNP’ler birkaç yöntemle üretilebilir ve metal partiküllerle birlikte indirgeyici maddeler ve kapatma maddeleri içerebilir. Kaplama stabiliteyi arttırdığı, aglomerasyonu azalttığı ve AgNP’lerin sitotoksisitesini azalttığı için, kaplı veya başlıklı AgNP’lerin düz AgNP’lerden daha avantajlı olduğu bulunmuştur. Kaplanmış AgNP’ler arasında, PVP başlıklı nanopartiküller biyolojik kullanım için geniş çapta incelenmiştir. AgNP’lerin PVP kaplamasının, diğer kaplama maddelerinin yaptığı sırada bunların antiviral aktivitesini engellemediği gözlemlenmiştir. PVP-AgNP10’un RSV ve HIV gibi zarflı virüslere karşı mükemmel antiviral aktiviteye sahip olduğu kanıtlanmıştır. Çalışma için PVP-AgNP10’u seçmenin mantığı buydu ve PVP-AgNP10’un SARS-CoV-2’ye karşı güçlü antiviral etkisini gösterdik.
AgNP’lerin antiviral etkisi de konsantrasyona bağlıdır. Çoğu çalışma, 10 ile 100 ppm arasında değişen konsantrasyonlarda AgNP’lerin antiviral etkinliğini gözlemlemiştir . Bununla birlikte, 0.5 ppm cAg’nin İnfluenza virüsünü inhibe etmede etkili olduğu gösterilmiştir ve antiviral aktivite gösterdiği bildirilen en düşük konsantrasyondur. Mevcut çalışmada, çıplak AgNP’lerin 1 ile 10 ppm arasında değişen konsantrasyonlarda SARS-CoV-2’yi inhibe ettiğini ve 20 ppm ve üzeri memeli hücrelerinde sitotoksik hale geldiğini gözlemledik.
AgNP’lerin memeli hücrelerine karşı sitotoksisitesi, hücre tipine ve ayrıca AgNP’lerin tipine bağlıdır. Mehrbod vd. 0.5 ppm’den daha yüksek konsantrasyonlarda çıplak cAg partikülleri ile Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) hücrelerinde sitotoksisite gözlemlemişlerdir. NaBH4 indirgeyici ajan içeren çıplak AgNP’lerin kolon adenokarsinom hücrelerinde 11 ppm’de apoptozu indüklediği görülürken, Sitrat ile stabilize edilmiş çıplak AgNP’lerin 30 ppm’den yüksek konsantrasyonlarda sitotoksisite sergilediği gözlenmiştir [21,22]. Bu bağlamda, PVP kaplı AgNP’lerin insan alveolar bazal epitel hücrelerinde 50 ppm’de bile kanıtlanabilir sitotoksisite olmadan en az sitotoksik olduğu gösterilmiştir. Daha küçük partiküller, bağlı proteinle daha büyük yüzey alanı etkileşimi nedeniyle daha yüksek toksik potansiyele sahiptir. Bu etkiyi AgNP2 2 ppm’de bile sitotoksisite gösterdiğinden, daha büyük partiküllerin hiçbiri bu konsantrasyonda sitotoksik olmadığından gözlemledik. Bu nedenle, Ag biyolojik yüzeylerde kullanıldığında dikkatli olunmalıdır.
Ag’nin çeşitli sindirilebilir ve solunabilir formülasyonları, tezgahtan satın alınabilen COVID-19 için tedavi olarak pazarlanmaktadır. Bu formülasyonların sitotoksik potansiyeli kişisel kullanımdan önce dikkate alınmalıdır. Ayrıca Ag, çok geniş spektrumlu bir mikrop öldürücüdür. Ag’nin yasadışı kullanımı, komensal mikrobiyotada bir dengesizlik yaratarak öngörülemeyen sonuçlara yol açabilir. AgNP’ler, devam eden COVID-19 pandemisiyle savaşmak için çeşitli cansız yüzeylerde kullanılabilir. Ag kaplı maskelerin SARS-CoV-2’yi inhibe etmede etkili olduğu ve klima ve tıbbi cihazların hava filtrelerine uygulandıklarında potansiyel olarak etkili olabileceği bulunmuştur AgNP içeren polikoton kumaşların SARS-CoV-2’yi inhibe ettiği kanıtlanmıştır. Ellerin ve cansız yüzeylerin dezenfeksiyonunda sırasıyla ag bazlı dezenfektanlar ve dezenfektanlar kullanılmaktadır. Ancak, AgNP’lerin çevrede salındığında mikrobiyal yaşamı etkileme üzerindeki etkisi bilinmemektedir. Ag içeren ürünler için, kullanımdan sonra atıldığında çevresel mikrobiyal modelde istenmeyen dengesizliklere neden olmaktan kaçınmak için uygun bir imha protokolü geliştirilmelidir.
Kaynak : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7486059/
Kaynak: https://safgumuscubuk.com/forum/konu/covid-19-ve-gumus-suyu/
Yorumlar
Yorum Gönder